Methoden der AG Molekulare Neurowissenschaften

Patch-Clamp [Whole-Cell und Single-Channel recording]

Mithilfe elektrophysiologischer Methoden k?nnen biophysikalische und pharmakologische Eigenschaften von Ionenkan?len und Rezeptoren funktional charakterisiert und Signalwege untersucht werden.

Laserscanning-Mikroskopie, Visualisierung der aktivit?tsabh?ngigen Translokation von fluoreszenzmarkierten Proteinen, FRET, FRAP, TIRF, Ca2+-Imaging

Hochaufl?sende Laserscanning Mikroskopie wird verwendet, um die Lokalisation markierter Proteine (Rezeptoren, Ionenkan?le, G-Proteine und deren Interaktionspartner) in zellul?ren und subzellul?ren Strukturen zu untersuchen. Die hochaufl?sende Analyse der r?umlich/zeitlichen Dynamik aktivit?tsabh?ngiger Translokation von fluoreszenzmarkierten Proteinen kann zur Aufkl?rung beteiligter Signalwege und Signalisierungsmechanismen beitragen.

Mithilfe von FRET und FRAP k?nnen direkte Protein/Protein Interaktionen analysiert werden. FRET nutzt dabei die r?umliche N?he interagierender Proteine, w?hrend FRAP die Mobilit?t der Interaktionspartner untersucht.

TIRF Mikroskopie bietet die M?glichkeit membrannah lokalisierte fluoreszenzmarkierte Proteine mit hoher r?umlicher Aufl?sung zu untersuchen. Die Translokation markierter Interaktionspartner zur oder von der Plasmamembran kann in hoher r?umlicher und zeitlicher Aufl?sung visualisiert werden.

Ca2+ Imaging Experimente erm?glichen die Messung der intrazellul?ren Ca2+ Ionen Konzentration und deren zeitliche ?nderung. Die Messungen k?nnen je nach Bedarf und Objekt in Zellkultur oder Gewebeschnitten erfolgen und Signalwege entlang nativer oder rekombinanter Ionenkan?le betreffen.

Mithilfe pharmakologischer Werkzeuge (spezifische Agonisten und Antagonisten, Aktivatoren und Inhibitoren, Kanalblocker) werden die funktionalen Eigenschaften von Ionenkan?len und Rezeptoren charakterisiert und die involvierten Signalwege identifiziert und analysiert.

Die Wirkung endogener oder synthetischer Wirksubstanzen (etablierte und neuartige Drugs) auf Ionenkan?le, Rezeptoren und Signalwege in einzelnen Zellen oder komplexen Netzwerken kann mit Hilfe elektrophysiologischer und bildgebender Verfahren analysiert werden.

Molekular- und zellbiologische Methoden (Klonierung, Subklonierung, Mutagenese, Zellkultur, viraler Gentransfer [rekombinante Adenoviren], transneuronales Tracing [rekombinante Pseudorabies Viren])

Die Kultur prim?rer Zellen und etablierter Zelllinien erlaubt die Untersuchung nativer Rezeptoren, Ionenkan?le und Signalwege, sowie rekombinanter Proteine in heterologen Expressionssystemen. Die Klonierung von Zielgenen und die Expression der Proteine erm?glicht die gezielte Analyse molekularer und funktionaler Eigenschaften in definierten Systemen. Ein Vergleich wild-typischer Proteine mit Rezeptoren oder Ionenkan?len die definierte Mutationen enthalten, erm?glicht die Untersuchung von Struktur/Wirkungs-Beziehungen und die Analyse funktionaler Dom?nen.

Der Einsatz von rekombinanten Viren erlaubt die gezielte Transformation von Zellen und Geweben, die mit herk?mmlichen Methoden nicht, oder nur unzureichend erreicht oder transfiziert werden k?nnen. Die Bedeutung einzelner Proteine für native Zellen kann durch RNAi vermittelten knock-down überprüft werden.

Die Untersuchung von Zell/Zell-Verbindungen und Projektionsbahnen kann in transneuronalen tracing-Studien untersucht werden.

Mit immunzytochemischen Methoden (in Kombination mit hochaufl?sender Mikroskopie) werden die Expression und Lokalisation von Zielproteinen in Geweben, Zellen und subzellul?ren Strukturen untersucht.

Proteinbiochemische Methoden (Aufreinigung, Chromatographie, Elektrophorese, Massenspektrometrie, Sequenzierung) k?nnen zur Analyse einer gewebe- und zellspezifischen Proteinexpression eingesetzt werden und erm?glichen die Identifizierung der target-Proteine und m?glicher Interaktionspartner.

Mithilfe chip-basierter Transkriptomanalysen und Hochdurchsatz-DNS-Sequenzierung sollen gewebs-, funktions- und krankheitsspezifische Expressionsmuster auch an Patientenmaterial (Blutzellen, Zellen der Nasenschleimhaut, Fibroblasten) untersucht sowie molekulargenetische Grundlagen von Krankheitsbildern identifiziert und analysiert werden. Identifizierte Proteine sollen dann funktional charakterisiert und somit das Verst?ndnis ihrer Bedeutung für die Pathologie vertieft werden.